專性厭氧菌的培養(yǎng)方法及注意事項

 一、專性厭氧菌的介紹

  根據(jù)細菌生長對氧的需求，主要可分為四大類：專性需氧菌、兼性厭氧菌、專性厭氧菌、微需氧菌。

  專性厭氧菌需要在嚴格無氧的氣體環(huán)境中生長，氧氣會對菌產(chǎn)生毒害作用，也有一些厭氧菌在含5%-10%二氧化碳氣體環(huán)境中可耐受低濃度的氧氣。常見的專性厭氧菌有梭菌屬（如產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌、艱難梭菌等）、雙歧桿菌屬（如嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌等）、擬桿菌屬、梭桿菌屬、厭氧消化鏈球菌屬等。

二、厭氧培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)造

  （1）使用厭氧培養(yǎng)箱，通氣培養(yǎng)。一些厭氧培養(yǎng)箱可同時進行接種等微生物操作，并直接進行培養(yǎng)，操作方便，成功率高，缺點是多數(shù)實驗室不具備，損耗較大，對于小規(guī)模的培養(yǎng)試驗來說，成本較高。

  （2）使用厭氧罐、厭氧盒或厭氧培養(yǎng)袋+厭氧產(chǎn)氣包，可制作小型或中型空間的厭氧環(huán)境，操作方便，不需要任何復(fù)雜的專門設(shè)備，可在所有實驗室中使用，非常適合實驗室中小規(guī)模的試驗操作。

注意事項：培養(yǎng)基必須與厭氧環(huán)境氣體流通，如使用試管、錐形瓶等容器培養(yǎng)，必須確保塞子透氣；培養(yǎng)平皿時，必須保證平皿的透氣性良好，不能使用封口膜密閉纏繞。

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  （3）液體培養(yǎng)基可采用覆蓋石蠟隔絕氧氣的方法，如皰肉培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基等，在培養(yǎng)基配制完成分裝后，在培養(yǎng)基上方覆蓋約0.5-1cm厚度的液體石蠟，再進行滅菌處理，可直接進行厭氧菌的培養(yǎng)，無需使用厭氧培養(yǎng)箱或厭氧罐等設(shè)備。

  注：在滅菌前覆蓋石蠟，滅菌過程中培養(yǎng)基中溶解的氧氣會逸出，冷卻后石蠟會阻隔空氣中氧氣的進入，可以更好的制造厭氧環(huán)境；培養(yǎng)基中也可補加一定量的還原性鐵粉或硫乙醇酸鈉、半胱氨酸等還原性成分，幫助維持厭氧環(huán)境。

  （4）有些培養(yǎng)基可自然的形成厭氧環(huán)境，無需厭氧培養(yǎng)，如硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，靜置過程會自發(fā)分層，下層為無氧環(huán)境，無需任何厭氧設(shè)備，也無需覆蓋液體石蠟，即可培養(yǎng)厭氧菌。

三、常見厭氧菌的培養(yǎng)基

1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

  此培養(yǎng)基常用于梭菌的活化及增菌培養(yǎng)，也可對營養(yǎng)成分進行改良用于一些營養(yǎng)要求較高的厭氧菌的培養(yǎng)，此培養(yǎng)基可自然的形成厭氧環(huán)境，無需厭氧培養(yǎng)，此培養(yǎng)基靜置過程會自發(fā)分層，下層為無氧環(huán)境，無需任何厭氧設(shè)備，也無需覆蓋液體石蠟，即可培養(yǎng)厭氧菌。

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2.皰肉培養(yǎng)基

  相比較于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基需覆蓋液體石蠟，用于培養(yǎng)梭菌時，可以存活更長時間（如生孢梭菌，在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中只能存活數(shù)天，而在皰肉培養(yǎng)基中可存活數(shù)月以上）。

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3.GAM/改良GAM培養(yǎng)基

  此培養(yǎng)基營養(yǎng)非常豐富，適用于絕大多數(shù)的厭氧菌培養(yǎng)，特別是用于比較難培養(yǎng)的營養(yǎng)苛求型細菌（如擬桿菌屬）。

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4.血平板/CDC厭氧菌瓊脂

  營養(yǎng)豐富，適用于絕大多數(shù)厭氧菌的培養(yǎng)（梭菌、擬桿菌等均可培養(yǎng)）。

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5.MRS瓊脂/肉湯

  用于雙歧桿菌的培養(yǎng)，制備好的MRS肉湯培養(yǎng)基澄清透明無沉淀，常用于乳酸菌或雙歧桿菌的活化、增菌及收集菌體。

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四、注意事項

  （1）培養(yǎng)基的制備

  需覆蓋石蠟的液體培養(yǎng)基，應(yīng)在滅菌前完成分裝并覆蓋液體石蠟；流體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基在有氧條件下培養(yǎng)厭氧菌時，使用前可采用沸水浴或其他除氧方式排出培養(yǎng)基內(nèi)溶解的氧氣.

  （2）操作過程

  因氧氣會對厭氧菌產(chǎn)生毒害作用，因此整個操作過程應(yīng)在專門的無氧設(shè)備中進行。如在正常空氣中操作，從厭氧菌暴露在空氣中開始到放入?yún)捬醐h(huán)境中培養(yǎng)結(jié)束，整個過程應(yīng)盡可能快速操作，一般不超過15分鐘，暴露時間越長，厭氧菌越容易死亡。

  （3）培養(yǎng)環(huán)境

  可采用厭氧罐、厭氧培養(yǎng)箱、厭氧產(chǎn)氣包等方式提供厭氧環(huán)境，除了確保氣體環(huán)境無氧之外，有些厭氧菌通常還需要5%-10%的二氧化碳、氫氣等氣體促進生長并提高厭氧菌對氧氣的耐受性，更容易培養(yǎng)成功。

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